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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11935 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Auf ultravioletter (UV)-Bestrahlung basierende Methoden zur Virusinaktivierung haben einen wichtigen Ansatz zur Bekämpfung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)-Virus geschaffen. Ein Hauptproblem der modernen UV-Inaktivierungstechnologie besteht darin, dass sie auf UV-Lampen basiert, die eine begrenzte Effizienz haben, eine hohe Leistung, große Dosen und lange Bestrahlungszeiten erfordern. Diese Nachteile schränken den Einsatz von UV-Lampen in Luftfiltersystemen und anderen Anwendungen ein. Um diese Einschränkungen zu beseitigen, berichten wir hier über die Herstellung eines Geräts, das einen gepulsten Nanosekunden-266-nm-UV-Laser umfasst, der an einen integrierenden Hohlraum (LIC) gekoppelt ist, der aus einem UV-reflektierenden Material, Polytetrafluorethylen, besteht. Frühere Hohlräume zur Inaktivierung von UV-Lampen basierten auf polierten Wänden mit spiegelnden Reflexionen, die diffus reflektierenden UV-ICs wurden jedoch nicht gründlich zur Virusinaktivierung untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das LIC-Gerät mehrere Atemwegsviren, einschließlich SARS-CoV-2, mit einer effektiven Bestrahlungszeit von ~ 1 ms inaktivieren kann, mit einer um > 2 Größenordnungen höheren Effizienz im Vergleich zu UV-Lampen. Die nachgewiesene Hohlraumvergrößerung um drei Größenordnungen im Vergleich zur direkten Belichtung ist entscheidend für die Entwicklung effizienter Echtzeit-UV-Luft- und Wasserreinigungssysteme. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Demonstration der LIC-Anwendung für eine umfassende Virusinaktivierung mit hoher Effizienz.

Um den Ausbruch der schweren globalen Pandemie des akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) zu bekämpfen, wurden verschiedene Nanomaterialien mit einstellbaren physikalischen und chemischen Eigenschaften für die Impfung und Behandlung von Patienten entwickelt1,2. Außerdem wurden Luftreiniger mit photoelektrochemischer Oxidation als potenzielle Instrumente zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Exposition in Innenräumen entwickelt3. Da sich die Pandemieviren jedoch über die Luft und Oberflächen ausbreiten, besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung schneller und effizienter Methoden, um Viruspartikel auf Oberflächen und in der Luft, insbesondere an öffentlichen Orten wie Krankenhäusern, Flughäfen, Geschäften usw., dagegen zu inaktivieren Pandemie und mögliche zukünftige Pandemien.

Derzeit werden verschiedene lichtvermittelte Desinfektionsprotokolle für Oberflächen-, Luft- und Wasserproben sowie persönliche Schutzausrüstung validiert4. UV-Bestrahlung als wirksame, berührungslose Methode zur Inaktivierung viraler Krankheitserreger wird seit langem eingesetzt, hauptsächlich in Form von Niederdruck-Quecksilberlampen oder Leuchtdioden5,6,7,8. UVC-Licht (im Bereich von 100–280 nm) weist unter den verschiedenen UV-Bereichen, einschließlich UVA (315–400 nm) und UVB (280–315 nm), die größte antimikrobielle und antivirale Inaktivierungseffizienz auf9. Die maximale Absorption von Nukleinsäuren liegt bei ~ 265 nm, wobei UVC-Licht Schäden verursacht, indem es die photochemische Fusion zweier benachbarter Pyrimidine zu kovalent verbundenen Dimeren, RNA-Protein-Vernetzung und ortsspezifische molekulare Schäden induziert10. UV-Strahlung wurde zur Behandlung von menschlichen Enteroviren, Zika, Hepatitis E, Dengue-Fieber, West-Nil-Fieber und anderen11,12,13,14,15,16,17,18,19 und kürzlich auch für SARS-CoV-220 untersucht ,21,22,23,24,25,26,27,28. Die viruzide Wirksamkeit von UV-Licht wird von einer Reihe von Faktoren beeinflusst, darunter dem Zielerreger, der Umgebung und dem zu dekontaminierenden Material29. Darüber hinaus wurde keimtötendes UV-Licht mit einer Wärmebehandlung zur Virusdesinfektion kombiniert30,31, einschließlich SARS-CoV-232. Zu den Problemen bei UV-Lampen gehört die begrenzte Effizienz, der Bedarf an hoher Leistung und langen Bestrahlungszeiten (große Dosen), was zeitaufwändig ist und für den Einsatz in vielen Klimaanlagen, in denen die Luft nur für sehr kurze Zeiträume an einer UV-Lampe vorbeiströmt, nicht geeignet ist von Zeit. Zu den Nachteilen des Erhitzens gehören ein geringer Wirkungsgrad und große Wärmeverluste an die Umgebung, die zusätzliche Kühlmaßnahmen erfordern und somit die Kosten der Inaktivierung erhöhen.

Darüber hinaus wurde berichtet, dass ultrakurze Laserpulse im sichtbaren (Vis) bei 425 nm und im nahen Infrarot (NIR) bei ~ 800 nm Viren inaktivieren33,34,35. Es wurde vermutet, dass die impulsiv stimulierte Raman-Streuung, die zur Aggregation viraler Kapsidproteine ​​führt, der Hauptinaktivierungsmechanismus ist33. Allerdings ist die Inaktivierungseffizienz der gepulsten Vis-NIR-Bestrahlung geringer als die der keimtötenden UVC-Lampen. Gepulste UVB-Laser, wie z. B. ein Nanosekunden-Excimer-308-nm-Laser, wurden ebenfalls zur Virusinaktivierung eingesetzt, zeigten jedoch eine geringe Effizienz, ähnlich wie Vis-NIR36. Hohe Wirkungsgrade wurden mit gepulsten UVC-Lasern wie 193-nm-Excimer-Lasern und 266-nm-Nd:YAG-Lasern der vierten Harmonischen erzielt37,38. Die gepulste Nanosekunden-UV-Laserbestrahlung mit 266 nm enthüllte den nichtlinearen Zweiquantenmechanismus der RNA-Protein-Vernetzung bei der Inaktivierung des Virus der venezolanischen Pferdeenzephalomyelitis (VEE) mit einer Steigerung der Quantenausbeute um mehr als eine Größenordnung im Vergleich zur 254-nm-UVC-Lampe38. Dies steht im Gegensatz zur linearen Ein-Photonen-Natur des herkömmlichen Pyrimidin-Dimer-Bildungsmechanismus, der sowohl bei gepulster UV-Laser- als auch bei UV-Lampenbestrahlung vorhanden ist. Die gepulste UV-Laserablation basiert auf einer Kombination mehrerer Mechanismen, einschließlich thermischer und photochemischer Zersetzung, die die Effizienz der Virusinaktivierung über die herkömmlicher UV-Lampen hinaus steigern können. UV-Pulse enthalten mehr Energie pro Zeiteinheit und können Lösungen weiter durchdringen als kontinuierliches UV-Licht37. Andererseits führen UV-Pulse zu einer stärkeren Absorption als Vis- oder NIR-Pulse, was zu einer wirksameren Inaktivierung führt.

Die Lichtabsorption kann durch die Kopplung von UV-gepulsten Lasern an integrierende Hohlräume (ICs) verbessert werden. Typische ICs haben eine sphärische Geometrie und Wände aus hochreflektierenden, diffus streuenden Materialien39,40. Die Lambertsche Lichtstreuung an den Wänden erzeugt gleichmäßige Felder innerhalb von ICs und große effektive optische Weglängen, die für sensorische und spektroskopische Anwendungen genutzt wurden41,42,43,44. Obwohl bereits verschiedene UV-Boxen und -Hohlräume zur Pathogeninaktivierung eingesetzt wurden45, sind die viruziden Eigenschaften von ICs noch nicht umfassend erforscht. Die diffuse Streuung von ICs hat gegenüber der spiegelnden Streuung herkömmlicher Hohlräume einen Vorteil, da sie einen größeren Bereich an Beleuchtungswinkeln bietet, der die Abschirmung von Viren durch Mikropartikel verringern kann. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass an ICs gekoppelte gepulste UV-Laser Viren effizienter und in kürzerer Zeit zerstören können. Um diese Hypothese zu testen, haben wir hier ein neues Virusinaktivierungsgerät entwickelt, das auf einem gepulsten Nanosekunden-266-nm-UV-Laser basiert, der an einen integrierenden Hohlraum gekoppelt ist und als Laser Integrating Cavity Device (LICD) bezeichnet wird. Wir untersuchten die Inaktivierung menschlicher Coronaviren wie SARS-CoV-246 und 229E Coronavirus (HCoV-229E)47 sowie des Respiratory Syncytial Virus (RSV)48. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LICD 99,9 % des Virus bei einer effektiven Gesamtbestrahlung von ~ 1 ms inaktivieren kann, was einer Effizienzsteigerung von > 3 Größenordnungen entspricht. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Demonstration der Verwendung eines gepulsten UVC-Lasers mit integrierter Kavität zur Inaktivierung des menschlichen Coronavirus, einschließlich SARS-CoV-2.

Es wurden zwei verschiedene Methoden der Laserbelichtung untersucht: (1) eine direkte Bestrahlung des Virus mit dem UV-Laserstrahl (Abb. 1a); (2) eine indirekte Exposition des Virus gegenüber der UV-Laserstrahlung, wenn es an einer zufälligen Stelle innerhalb des LICD-Gehäuses platziert wird (Abb. 1b). Wir haben das LICD entworfen, indem wir den gepulsten 266-nm-Nanosekunden-UVC-Laser an ein zylindrisches IC-Gehäuse aus einer stark UV-reflektierenden Polytetrafluorethylen (PTFE)-Beschichtung gekoppelt haben49,50. Detaillierte Schaltpläne und räumliche Abmessungen des LICD sind in Abbildung S1 dargestellt. Für die direkte Exposition wurde ein Plastikfläschchen horizontal platziert, wie in Abb. 1a gezeigt, und ein Viruströpfchen wurde am Boden des Fläschchens gehalten. Für die LICD-Exposition wurde ein Fläschchen zufällig am Boden und das zweite Fläschchen zufällig an der Seitenwand des Gehäuses platziert, wie in Abb. 1c gezeigt.

Virusinaktivierung durch ultraschnellen UVC-Laser mit integriertem Hohlraum. (a) Schematische Darstellung der direkten Bestrahlung eines Tropfens einer Viruslösung in einem Fläschchen mit einem gepulsten UVC-Laser. (b) Schematische Darstellung der LICD-Bestrahlung mit UVC-Laserstrahlung auf ein Viruströpfchen, das im Hohlraum an der Stelle der Öffnung a2 platziert wird. (c) Foto des Hohlraums mit einem Viruströpfchen in einem Fläschchen. (d) Foto des mit UVC-Laserlicht gefüllten Hohlraums und der Reflexion der Fluoreszenz aus dem 2. Durchgang und der Mehrdurchgangsstreuung als zwei helle Punkte auf einer weißen Karte, platziert an der a2-Blende. (e) AFM-Höhenbild einer PTFE-Folie, die als diffus reflektierende LICD-Hohlraumwand verwendet wird. (f, g) AFM-Höhenbilder der unbehandelten (U) und UVC-Laser-behandelten (T) HCoV-229E-Virionen. Der Maßstabsbalken beträgt 0,3 µm. (h) Durchschnittliche Höhe und Breite der unbehandelten und behandelten HCoV-229E-Virionen.

Nachdem der einfallende Laserstrahl an der Innenwand des Gehäuses reflektiert wird, wird das diffus gestreute Licht mehrfach reflektiert und füllt so das gesamte Volumen gleichmäßig aus. Die Effizienz der diffusen Streuung kann abgeschätzt werden, indem die Helligkeit der beiden Fluoreszenzpunkte auf einer weißen Karte beobachtet wird, die an der Austrittsöffnung des Hohlraums platziert wird (Abb. 1d). Der Punkt aus dem 2. Durchgang wird durch den einfallenden Laserstrahl direkt von der Hohlraumwand reflektiert. Der Fleck aus der Multipass-Streuung weist eine ähnliche Helligkeit auf, was auf ein hohes diffuses Reflexionsvermögen der Hohlraumwände hinweist. Die PTFE-Beschichtung weist aufgrund der porösen Struktur eine omnidirektionale diffuse Reflektivität von > 93 % auf.

Wir untersuchten die morphologischen Eigenschaften der IC-Wände mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM). Abbildung 1e zeigt das AFM-Höhenbild der PTFE-Folie, die als reflektierendes Material für den IC verwendet wird. Die beobachteten Unregelmäßigkeiten sind auf das Vorhandensein von Nanopartikeln und Poren zurückzuführen, die in Abbildung S2a durch weiße gestrichelte Linien hervorgehoben sind. Die AFM-Analyse in Abbildung S2b ergab eine durchschnittliche Partikelgröße von 0,44 µm und eine durchschnittliche Porengröße von 1,86 µm. AFM-Profile eines typischen Partikels und einer Pore sind in den Abbildungen S2c bzw. S2d dargestellt. Um die morphologischen Veränderungen zu beobachten, die durch die Belichtung mit gepulstem UVC-Laser verursacht werden, führten wir AFM-Messungen an den unbehandelten (nicht bestrahlten) und behandelten (mit direkt gepulstem UVC-Laser bestrahlten) HCoV-229E-Virionen durch (Abb. 1f, g). Das behandelte Virus wurde 30 Minuten lang bestrahlt. Die 30-minütige Behandlung wurde gewählt, um eine vollständige Inaktivierung sicherzustellen (mehr als 99,99 %, siehe unten). Für die statistische Analyse wurden zehn Virionen sowohl aus behandelten als auch aus unbehandelten Proben ausgewählt. Die durchschnittliche Höhe der unbehandelten Virionen betrug ~ 31 nm, während die behandelten Virionen eine durchschnittliche Höhe von ~ 19 nm aufwiesen (Abb. 1h). Die lateralen Breitenprofile zeigten eine durchschnittliche Breite der unbehandelten Virionen von ~ 159 nm und der behandelten Virionen von ~ 82 nm (Abb. 1h).

Die AFM-Höhenprofile der typischen Beispiele der unbehandelten und behandelten Virionen sind in den Abbildungen S3a und S3b dargestellt. Diese Ergebnisse deuten auf eine Schrumpfung der Viruspartikel nach der Einwirkung ultrakurzer UVC-Laserpulse hin und bestätigen den Beitrag des Ablationsmechanismus zur Virusinaktivierung.

Um die Inaktivierung des Coronavirus zu untersuchen, verwendeten wir eine direkte Bestrahlung mit dem 266 nm Nanosekunden-UVC-Laser, um das HCoV-229E-Virus zu inaktivieren. Ein 6 μl Viruströpfchen in PBS wurde wie oben beschrieben in ein Fläschchen gegeben. Die Laserbestrahlungszeiten von 1, 5, 10 und 30 s entsprechen den Dosen 3,5, 17,6, 35,3 und 105,9 mJ/cm2. Bei direkter Bestrahlung mit einem UVC-Laser war die HCoV-229E-Replikation nach 4 s Bestrahlung vollständig inaktiviert (99,9 % Reduktion), was einer Dosis von 15,6 ± 0,3 mJ/cm2 entspricht, gemessen mit qPCR für 229E-Spike (S) (Abbildung S4a) und Nukleokapsid (N) (Abb. 2a) Transkripte nach 72 Stunden Infektion in Calu-3-Zellen. Um die Auswirkungen der indirekten Exposition gegenüber dem UVC-Laser auf die Virusreplikation innerhalb des IC-Gehäuses zu untersuchen, führten wir die LICD-Exposition eines HCoV-229E-Viruströpfchens in PBS durch, das in einem Fläschchen an zwei zufälligen Positionen innerhalb des IC platziert wurde (dargestellt in Abbildung S1). mit den Bestrahlungszeiten 10, 30, 120 und 1800 s, was Dosen von 0,05, 0,15, 0,6 bzw. 9 mJ/cm2 entspricht. Nach der UV-Dosis von 0,63 ± 0,02 mJ/cm2 wurde die HCoV-229E-Virusreplikation inaktiviert (99,9 % Reduktion), gemessen durch qPCR für 229E S- (Abbildung S4b) und N-Proteine ​​(Abb. 2b) nach 72 Stunden Infektion Calu-3-Zellen (Abbildung S5).

Das HCoV-229E-Virus wurde für die angegebene Zeit einem direkt gepulsten UVC-Laser (a) und einem Hohlraum (b) ausgesetzt. Calu-3-Zellen wurden 24 Stunden nach der Aussaat mit den angegebenen Gruppen von 229E (3 MOI) behandelt. 72 Stunden nach der Infektion wurde die RNA extrahiert und eine qPCR durchgeführt. Dargestellt ist die durchschnittliche Faltungsänderung ± SEM im Vergleich zur Negativkontrolle (NC) (N = 3). Zur Bestimmung der Signifikanz im Vergleich zu 0 s wurden eine 1-Wege-ANOVA und ein Dunnett-Post-hoc-Test verwendet. HCoV-229E-Überleben als Funktion der UV-Bestrahlungszeit über direkte Exposition (c) und Hohlraum (d). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Abbildung 2c zeigt das logarithmisch lineare Überlebensdiagramm der direkten Inaktivierungskinetik, wobei N0 und N die Anfangs- und Endkonzentrationen der infektiösen Viruseinheiten sind, die aus der qPCR-Analyse ermittelt wurden. Nur der lineare Teil des Diagramms wurde in Übereinstimmung mit dem allgemeinen Ansatz51 angepasst, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Die lineare Regressionsanpassung ergab eine Inaktivierungsratenkonstante von k = 0,443 ± 0,006 mJ/cm2. Abbildung 2d zeigt das LICD-Überlebensdiagramm und die lineare Regressionsanpassung mit der Inaktivierungsratenkonstante k = 10,9 ± 0,4 mJ/cm2. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl die direkte als auch die LICD-Exposition gegenüber gepulstem UVC-Laser die Fähigkeit des Virus, sich in Wirtszellen zu replizieren, auslöscht. Allerdings ist der LICD um eine Größenordnung wirksamer, da er eine geringere Dosis erfordert, um eine ähnliche Inaktivierung zu erreichen.

Als nächstes führten wir eine direkte Bestrahlung mit dem 266 nm Nanosekunden-UVC-Laser durch, um SARS-CoV-2 zu inaktivieren. Für die Direkt- und LICD-Exposition verwendeten wir wie oben beschrieben ein 23-μl-Viruströpfchen in PBS in einem Fläschchen. Die Bestrahlungszeiten von 30, 60, 120 und 300 s entsprechen Dosen von 105,9, 211,8, 423,6 bzw. 1059 mJ/cm2. Bei direkter Bestrahlung mit einem UVC-Laser wurde die SARS-CoV-2-Replikation nach 3 Minuten und einer Bestrahlung mit einer Dosis von 715 mJ/cm2 inaktiviert (99,9 %), gemessen mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 3a–d) und qPCR für SARS-CoV-2 S- (Abbildung S6a) und N-Proteine ​​(Abb. 3i) nach 48 Stunden Infektion in Calu-3-Zellen. Anschließend führten wir die LICD-Exposition von SARS-CoV-2 mit Bestrahlungszeiten von 30, 60, 120 und 300 s durch, was Expositionsdosen von 0,15, 0,3, 0,6 bzw. 1,5 mJ/cm2 entspricht. Nach der UV-Dosis von 0,60 ± 0,02 mJ/cm2 wurde die Virusreplikation inaktiviert (99,9 % Reduktion), gemessen mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 3e–h) und qPCR für SARS-CoV-2 S (Abbildung S6b) und N ( Abb. 3j) Transkripte nach 48 Stunden Infektion in Calu-3-Zellen. Bei einer SARS-CoV-2-Infektion kommt es in der Regel zu einem pathologischen Anstieg des Entzündungsproteins TNF-α46. Nach Exposition gegenüber direkter (Abb. 3k) und LICD- (Abb. 3l) UVC-Laserbestrahlung führt eine SARS-CoV-2-Infektion jedoch zu einer deutlich geringeren TNF-α-Expression in Calu-3-Zellen. Die lineare Regressionsanalyse der Überlebenskurve für die direkte Exposition in Abb. 3m ergab eine Inaktivierungsratenkonstante von k = 0,00965 ± 0,00004 mJ/cm2. Die lineare Regressionsanpassung für den LICD in Abb. 3n ergab eine Inaktivierungsratenkonstante von k = 11,2 ± 0,1 mJ/cm2. Dies zeigte, dass LICD um drei Größenordnungen effizienter war als die direkte Exposition.

Das SARS-CoV-2-Virus wurde den angegebenen Bestrahlungszeiten mit direktem UVC-Laserlicht oder Hohlraum-UVC-Laserlicht ausgesetzt. Calu-3-Zellen wurden 24 Stunden nach der Aussaat mit den angegebenen CoV-2-Gruppen (0,1 MOI) infiziert. (a–h) Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Infektion mit dem EVOS-Mikroskop (Thermo Fisher) aufgenommen. 200X. Maßstabsbalken = 200 µm. (i–j) SARS-CoV-2 N-Proteinexpression in Calu-3-Zellen. 72 Stunden nach der Infektion wurde die RNA extrahiert und eine qPCR durchgeführt. Dargestellt ist die durchschnittliche Faltungsänderung ± SEM im Vergleich zur Negativkontrolle (NC) (N = 3). Zur Bestimmung der Signifikanz im Vergleich zu 0 s wurden eine 1-Wege-ANOVA und ein Dunnett-Post-hoc-Test verwendet. (k–l) Expression von Entzündungsmarkern in Calu-3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-Infektion. Für die Negativkontrolle wurde CoV-2 2 Minuten lang unter einem Handstab UVC-Licht ausgesetzt. 48 Stunden nach der Infektion wurde die RNA extrahiert und eine qPCR durchgeführt. Dargestellt ist die durchschnittliche Faltungsänderung ± SEM im Vergleich zur Negativkontrolle (NC) (N = 3). Zur Bestimmung der Signifikanz im Vergleich zu 0 s wurden eine 1-Wege-ANOVA und ein Dunnett-Post-hoc-Test verwendet. SARS-CoV-2-Überleben als Funktion der Bestrahlungszeit bei direkter Exposition (m) und Hohlraum (n). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Als nächstes verwendeten wir den Calu-3-Zellkulturüberstand aus dem vorherigen Experiment, um eine neue Charge von Calu-3-Zellen erneut mit SARS-CoV-2 zu infizieren. Der Zellkulturüberstand, der das SARS-CoV-2-Virus enthielt, wurde dem direkten Laser oder LICD ausgesetzt, um das Virus zu inaktivieren. Die Laserbestrahlungszeiten betrugen 60 und 120 s mit Dosen von 211,8 und 423,6 mJ/cm2 für die direkte Belichtung und 0,3 und 0,6 mJ/cm2 für LICD. Bei direkter Einwirkung des UVC-Lasers wurde die SARS-CoV-2-Replikation bei einer Dosis von 211,8 mJ/cm2 vollständig inaktiviert, gemessen mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 4a–c) und qPCR für das SARS-CoV-2N-Transkript (Abb. 4e). nach 48 Stunden Infektion in Calu-3-Zellen. Nach der UV-Dosis von 0,6 mJ/cm2 wurde die Virusreplikation im LICD inaktiviert, gemessen mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 4d) und qPCR für SARS-CoV-2N-Transkripte (Abb. 4f) nach 48 Stunden Infektion in Calu-3 Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Coronavirus-Proben, einschließlich SARS-CoV-2, nach der Exposition gegenüber dem direkt gepulsten UVC-Laser oder LICD nicht mehr in der Lage sind, eine produktive Infektion in kultivierten Zellen auszulösen.

Reinfektion von Calu-3-Zellen mit Kulturüberstand von SARS-CoV-2-infizierten Calu-3-Zellen, die direktem oder Hohlraum-UVC-Laserlicht ausgesetzt wurden (Abb. 3). (a–d) Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Infektion mit einem EVOS-Mikroskop (Thermo Fisher) aufgenommen. 200X. Maßstabsbalken = 200 µm. (e–f) SARS-CoV-2 N-Proteinexpression in Calu-3-Zellen. 48 Stunden nach der Infektion wurde die RNA extrahiert und eine qPCR durchgeführt. Dargestellt ist die durchschnittliche Faltungsänderung ± SEM im Vergleich zur Negativkontrolle (NC) (N = 3). Zur Bestimmung der Signifikanz im Vergleich zu 0 s wurden eine 1-Wege-ANOVA und ein Dunnett-Post-hoc-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Um LICD an einem anderen Atemwegsvirus zu testen, setzten wir als nächstes das RSV-Virus, das rot fluoreszierendes Protein (RSV-RFP) exprimiert, einem direkten gepulsten 266-nm-Nanosekunden-UV-Laser mit Bestrahlungszeiten von 1, 5 und 15 s mit entsprechenden Dosen von 3,5, 17,6 und 52,9 aus mJ/cm2 (Abbildungen S7a-h). Eine Dosis von 17,6 mJ/cm2 führte bei Beobachtung mittels Fluoreszenzmikroskopie 72 Stunden nach der Infektion zu einer vollständigen Virusinaktivierung in Hep2-Zellen. Das RSV-RFP-Virus wurde dann dem LICD ausgesetzt, das RSV-RFP in Hep-2-Zellen 72 Stunden nach der Infektion erfolgreich inaktivierte, wenn es Dosen von nur 0,3 mJ/cm2 ausgesetzt wurde, jedoch wurde auch eine Dosis von 0,05 mJ/cm2 inaktiviert der größte Teil des Virus (Abbildungen S7i-p).

Als Kontrollmessung haben wir das RSV-RFP-Virus auch direkt einem 337 nm gepulsten Nanosekunden-UVB-Laser ausgesetzt (Abbildung S8). Die UVB-Laserbestrahlung hatte keine hemmende Wirkung auf die RSV-RFP-Virusreplikation in Hep-2-Zellen. Diese Ergebnisse bestätigen den Einsatz von UVC-gepulster Laserstrahlung zur Virusinaktivierung. Wir führten zusätzliche Kontrollmessungen mit zwei verschiedenen UVC-Lampenquellen zur Virusinaktivierung durch, einer Stratalinker-Einheit (Abbildung S9) und einem Handstab (Abbildung S10). Beide UVC-Lampen waren in der Lage, die RSV-RFP-Virusreplikation in Hep2-Zellen 72 Stunden nach der Infektion mit einer Bestrahlungszeit von 5 Sekunden und einer Dosis von 68,5 mJ/cm2 zu inaktivieren, wie durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Mit dem LICD (Dosis von 0,6 mJ/cm2, Tabelle 1) wurde jedoch eine um zwei Größenordnungen höhere Inaktivierungseffizienz erzielt.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der linearen Regressionsanalyse der Inaktivierungskinetik von HCoV-229E und SARS-CoV-2. Die Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten k wurden aus den im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Überlebenskurven erhalten. Tabelle 1 zeigt auch die UVC-Dosis, die zur Inaktivierung von 90 % (D90), 99 % (D99) und 99,9 % (D99,9) erforderlich ist. D99,9 stellt die „vollständige Inaktivierung“ dar, die 715 mJ/cm2 für SARS-CoV-2 bei direkter Exposition erfordert, während bei der LICD nur 0,6 mJ/cm2 erforderlich sind. Dieser Unterschied wird als Hohlraumverstärkungsfaktor (EF) von 1160 (Tabelle 1) quantifiziert, der durch die EF-Gleichung im Abschnitt „Methoden“ angegeben wird.

Die vollständige Inaktivierung (99,9 %) von HCoV-229E erforderte 15,6 mJ/cm2 für die direkte Exposition, während bei Verwendung des LICD nur 0,63 mJ/cm2 erforderlich waren (Tabelle 1), was aufgrund des Hohlraums zu einem EF von 25 führte. Die Inaktivierungsratenkonstante für den LICD von k = 10,9 mJ/cm2 war ähnlich der von SARS-CoV-2 für den LICD. Allerdings wurde eine größere Geschwindigkeitskonstante von k = 0,44 mJ/cm2 für die direkte gepulste UVC-Exposition von HCoV-229E im Vergleich zu k = 0,01 mJ/cm2 für SARS-CoV-2 erhalten. Dieser Unterschied könnte auf eine geringere Tröpfchengröße (6 μl) sowie strukturelle und morphologische Unterschiede zurückzuführen sein.

Die erhaltene Inaktivierungsratenkonstante für die LICD-Exposition k = 11,2 mJ/cm2 ist mehr als eine Größenordnung größer als die zuvor beobachteten Geschwindigkeitskonstanten für die meisten ssRNA-Viren unter Verwendung von UVC-Lampen bei 254 nm und etwa fünfmal größer als die für SARS-CoV vorhergesagte -251. Andererseits ist der beobachtete k = 0,01 mJ/cm2 für die direkte Exposition um eine Größenordnung niedriger als die typischen Literaturwerte für andere ssRNA-Viren, die 254-nm-Lampen verwenden. Dieser Unterschied könnte durch die unterschiedlichen Versuchsbedingungen wie die relativ große Tröpfchengröße der SARS-CoV-2-Lösung (23 μl) und das Fehlen von Rühren erklärt werden. Diese Effekte könnten zu einer Lichtabschwächung in der Probe und niedrigeren k-Werten führen. Beachten Sie, dass diese Effekte jedoch keinen Einfluss auf die EF-Werte haben, die die Erhöhung der Inaktivierungseffizienz aufgrund des IC-Effekts zeigen.

Ein wesentlicher anwendungstechnischer Unterschied zwischen der UVC-Lampe und einer gepulsten UVC-Laserbestrahlung liegt in der effektiven Bestrahlungszeit, die beim gepulsten Laser deutlich kürzer ist. Die Gesamtdauer der Laserbelichtung pro Zeiteinheit kann durch Multiplikation der Nanosekunden-Pulsdauer mit der Pulswiederholungsrate ermittelt werden. Dies führt dazu, dass die effektive Gesamtbestrahlungszeit zur Inaktivierung sowohl des HCoV-229E- als auch des SARS-CoV-2-Coronavirus mit LICD etwa 1 ms beträgt, während die Inaktivierung von RSV nur etwa 0,1 ms beträgt. Für die Direktbelichtung sind ähnliche Inaktivierungszeiten erforderlich, allerdings mit höheren Dosen aufgrund der unterschiedlichen Beleuchtungsflächen der Direktbelichtung (~ 0,2 cm2) im Vergleich zur LICD (~ 200 cm2). Aufgrund der Unterschiede in der Genomorganisation und Zusammensetzung der Nichtstrukturproteine ​​dieser drei Viren können wir die weitreichende Inaktivierungsfähigkeit des gepulsten UVC-Lasers und des LICD nachweisen.

In diesen Studien führten wir eine schnelle Inaktivierung von Viren mithilfe eines gepulsten 266-nm-Nanosekunden-UVC-Lasers durch, um ein breites antivirales LIC-Gerät zu entwickeln. Um dieses neuartige System zu testen, verwendeten wir drei verschiedene Arten von Viren, darunter HCoV-229E, RSV-RFP und SARS-CoV-2. Ein Vergleich des LICD, das unter Verwendung eines stark UV-diffus streuenden Materials PTFE hergestellt wurde, mit der direkten Einwirkung des UVC-Laserstrahls zeigte eine effiziente Virusinaktivierung nach Einwirkung von LICD. Die zur Inaktivierung benötigte Zeit könnte durch eine Erhöhung der Laserleistung, den Einsatz zusätzlicher optischer Elemente und die Verbesserung der diffusen Reflexionseigenschaften des Geräts durch fortschrittlichere reflektierende Materialien weiter verkürzt werden. Über die Virusinaktivierung hinaus kann die Anwendung von LICD auch auf andere Krankheitserreger wie Bakterien52,53,54 und Schimmelpilze55 ausgeweitet werden. Der technologische Fortschritt bei der Entwicklung von UV-Lasern soll die Kosten senken und die LICD-Technologie in naher Zukunft allgemein verfügbar machen. Die Anwendung von LICD auf Luft- und Wasserreinigungssysteme wird von der erhöhten Inaktivierungseffizienz profitieren. LICD-basierte Klimaanlagen können in geschlossenen Räumen wie Flugzeugen, Geschäften und Büros verwendet werden. LICD-basierte Wasseraufbereitungssysteme können in Haushalten und Industrieumgebungen eingesetzt werden. PTFE-beschichtete Wasserrohre wären in Verbindung mit ihren Antifouling-Eigenschaften für die Abwasserbehandlung nützlich56.

Aufgrund des geschlossenen Schutzes des UVC-exponierten Volumens durch den Hohlraum kann der LICD an öffentlichen Orten verwendet werden. Im Allgemeinen kann die Einwirkung von UVC-Strahlung auf die Haut oxidative Schäden verursachen, entweder durch die direkte Absorption von UV-Strahlung oder durch die reaktiven Sauerstoffspezies57. Es wurde jedoch berichtet, dass niedrige Dosen von Fern-UVC-Licht (207–222 nm) für das exponierte menschliche Gewebe harmlos sein können7. Darüber hinaus wurden Aluminium-Nanopartikel als Abschirmmittel in einem quantenmedizinischen Ansatz auf Basis von UV-Strahlung vorgeschlagen, um das Risiko einer Lichtschädigung von gesundem Gewebe deutlich zu verringern und gleichzeitig Krankheitserreger zu inaktivieren58.

Zelllinien (Calu3 und Hep2) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA) erworben und nicht mehr als 25 Mal passagiert. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 (Kohlendioxid) kultiviert. Die Zellen wurden in mit Gewebekultur behandelten Platten in den entsprechenden vollständigen Zellkulturmedien [HEP2 = DMEM (GE Healthcare) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Atlanta Biologicals) und 1 % Penicillin/Streptomycin (GE Healthcare)] kultiviert [Calu3 = MEM (GE Healthcare) enthält 20 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (GE Healthcare), 1 % 100 mM Natriumpyruvat (Gibco) und 1 % Penicillin/Streptomycin].

In diesen Experimenten wurden drei verschiedene Viren verwendet. Rot fluoreszierendes Protein (RFP), das das Respiratory Syncytial Virus (RSV-RFP), das menschliche Coronavirus 229E (HCoV-229E) und SARS-CoV-2 exprimiert. HCoV-229E wurde von BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Human Coronavirus, 229E, NR-52726. SARS-CoV-2 wurde uns von Dr. Pei-Yong Shi von der University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, USA, zur Verfügung gestellt59. Der in allen Experimenten verwendete RSV-Stamm (RSV-RFP) war ein rekombinanter A2-Stamm, der einen roten Fluoreszenzmarker, mKate2, sowie das F-Protein aus der klinischen Stammlinie 19 (rA2-KL19F) exprimierte. Die Handhabung und Lagerung von RSV-RFP und HCoV-229E, einschließlich aller experimentellen Verfahren, wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Handhabung, Lagerung und Experimente mit SARS-CoV-2 wurden in einem BSL-3-Labor durchgeführt. Für alle Experimente wurde eine Monoschicht aus Hep2- (RSV-RFP) oder Calu3-Zellen (SARS-CoV-2 und HCoV-229E) bei 80 % Konfluenz mit verschiedenen Konzentrationen des angegebenen Virus-MOI infiziert (wie in den Legenden der Abbildungen angegeben). Anschließend wurden die Zellen mit dem viralen Inokulum in Opti-MEM (Life Technologies) 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurde das infektiöse Medium durch frisches Wachstumsmedium ersetzt. Zur Abbildung der Zellen wurde Fluoreszenzmikroskopie (Keyence BZ-X800 oder EVOS) verwendet und anschließend wurden die Zellpellets für die RNA-Analyse gesammelt.

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus Zellpellets mit Trizol (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die RNA wurde mit dem Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Anschließend wurde ein Mikrogramm RNA mit dem Maxima cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers revers transkribiert. Die an der cDNA durchgeführte qPCR wurde verwendet, um die relativen Expressionsniveaus bestimmter Gene im Vergleich zu β-Actin als Kontrolle zu quantifizieren. Die Echtzeitanalyse wurde mit BlazeTaq SYBR Green qPCR Mix 2.0 (Genecoepia) gemäß dem Protokoll des Herstellers in einem Bio Rad CFX-384-Thermocycler unter Verwendung von Primern von Integrated DNA Technologies (IDT) durchgeführt. Die Daten wurden mithilfe von ΔΔCt-Berechnungen analysiert und die Expression aller Gene wurde auf die β-Actin-Expression als Haushaltsgen normalisiert. Anschließend wurde die durchschnittliche Faltungsänderung ± SEM im Vergleich zur Kontrolle berechnet. Die Datenanalyse wurde mit der CFX Maestro-Software (Bio-Rad) durchgeführt.

Wir konstruierten den zylindrisch geformten Integrationshohlraum (IC) unter Verwendung einer hochreflektierenden porösen PTFE-Folie (Thorlabs) mit einer Dicke von 0,75 mm, die einen UVC-Reflexionsgrad von > 93 % aufwies. Die schematischen Diagramme und räumlichen Abmessungen sind in Abbildung S1 dargestellt.

Die Vergrößerung des optischen Wegs im IC kann mithilfe des Ansatzes von Fry et al.39,42 geschätzt werden. Der durchschnittliche Abstand zwischen Reflexionen innerhalb eines integrierenden Hohlraums \(\overline{d }\) = 4,1 cm ist gegeben durch \(\overline{d }\) = 4\(\frac{V}{S}\), wobei V ist das Hohlraumvolumen und S ist die Oberfläche. Die durchschnittliche Pfadlänge innerhalb des IC, L = 63 cm, wurde durch L = 4\(\frac{V}{S(1-\rho)}\ berechnet, wobei \(\rho\) = 0,935 das IC-Reflexionsvermögen ist geschätzt aus dem Reflexionsvermögen von PTFE bei 266 nm. Der Hohlraumverstärkungsfaktor (EF) für jedes Virus wurde berechnet durch EF = \(\frac{{k}_{Kavität}}{{k}_{direkt}}\), wobei \({k}_{direkt} \) und \({k}_{Cavity}\) ist die Inaktivierungsratenkonstante für die direkte und LICD-Exposition, wie unten beschrieben.

Die folgenden UV-Quellen wurden verwendet: (i) Die gepulste UVC-Quelle war ein 266 nm Nd:YAG-Nanosekunden-Pulslaser (JDS Uniphase NanoLaser™) mit einer durchschnittlichen Leistung von 1 mW, einer zeitlichen Pulsdauer von ~ 1 ns und einer Wiederholungsrate von 10 kHz. (ii) Die gepulste UVB-Quelle war ein 337-nm-Stickstofflaser (VSL-337ND) mit einer durchschnittlichen Leistung von 5,2 mW, einer zeitlichen Impulsdauer von < 4 ns und einer Wiederholungsrate von 10 Hz. (iii) Die Cw-UVC-Lampe (Stratalinker® UV Crosslinker 1800) hatte 5 Lampen mit jeweils 8 W und einer Wellenlänge von 254 nm. (iv) Die Cw-UVC-Lampe (Handheld Wand, Clear-Raze™) hatte eine Glühbirne mit 18 W und einer Wellenlänge von 254 nm.

Die Ergebnisse der Inaktivierungsexperimente wurden anhand der qPCR-Daten zur relativen Genexpression analysiert (Abb. 2 und 3). Die linearen Regressionsparameter in Tabelle 1 wurden unter Verwendung der Kinetik erster Ordnung berechnet, die durch ln(N/N0) = −k D gegeben ist, wobei N/N0 die Überlebensfraktion ist, N die relative Genexpression bei jeder UV-Dosis (D) ist, und N0 ist die relative Genexpression bei einer Dosis von Null. Die Experimente wurden in 3 Replikaten für HCoV-229E und 4 Replikaten für SARS-CoV-2 durchgeführt. Die Inaktivierungsratenkonstante k (mJ/cm2) wurde für jeden Virusstamm und sowohl für direkte als auch für LICD-Expositionen berechnet. Die Lastreduktionsdosen zur Inaktivierung von 90 % (D90), 99 % (D99) und 99,9 % (D99,9) des Virus sind gegeben durch: D90 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0,9] }{k}\), D99 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0,99]}{k}\) und D99,9 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1 -0,999]}{k}\).

Virustropfen wurden mit 10 % phosphatgepuffertem Formalin 20 Minuten lang inaktiviert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Messungen der Rasterkraftmikroskopie (AFM) (OmegaScopeR, Horiba Scientific) wurden unter Verwendung einer Si-Spitze (Micromash) im Klopfmodus mit einem durchschnittlichen Abstand zwischen Spitze und Probe von 20 nm auf Viren durchgeführt, die durch Tropfengießen auf einem SiO2/Si-Substrat abgeschieden wurden. Für AFM wurde ein 2 µm x 2 µm großer Scanbereich ausgewählt, der aus mehreren Virionen bestand, von denen 10 Virionen ausgewählt wurden, um die Höhe und Breite der behandelten und unbehandelten Virionen zu berechnen und zu vergleichen.

Die Experimente wurden dreimal mit drei Wiederholungen in jedem Experiment wiederholt. Beim Vergleich mehrerer Gruppen wurde die statistische Signifikanz für jedes Experiment mithilfe der Varianzanalyse (ANOVA) und des Dunnett-Post-hoc-Tests bestimmt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Berechnungen wurden durchgeführt und Grafiken mit der Software Prism 6.0 (GraphPad) erstellt. Ergebnisdiagramme zeigen den Mittelwert und Fehlerbalken zeigen den Mittelwert plus oder minus dem Standardfehler des Mittelwerts.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage bei einem entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wird teilweise durch einen Senior Research Career Scientist Award an SSM (IK6BX006032) und einen Research Career Scientist Award an SM (IK6BX004212) sowie die Veterans Affairs Merit Review Awards an SSM (BX003685) und SM (BX005490 und BX003413) unterstützt. Obwohl dieser Bericht auf Arbeiten basiert, die teilweise vom Department of Veterans Affairs, der Veterans Health Administration und dem Office of Research and Development unterstützt werden, gibt der Inhalt dieses Berichts nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten wieder . Darüber hinaus wird diese Arbeit teilweise durch den Entwicklungszuschuss der University of South Florida an DVV und PRRN-Rapid COVID-Zuschüsse an SSM und SM unterstützt

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Sharad Ambardar, Mark C. Howell und Karthick Mayilsamy.

Fakultät für Medizintechnik, University of South Florida, USF Cherry Drive ISA 6049, Tampa, FL, 33620, USA

Sharad Ambardar & Dmitri V. Voronin

Abteilung für Veteranenangelegenheiten, James A. Haley Veterans Hospital, Tampa, FL, 33612, USA

Mark C. Howell Jr., Andrew McGill, Ryan Green, Subhra Mohapatra und Shyam S. Mohapatra

Abteilung für Innere Medizin, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2511, Tampa, FL, 33612, USA

Mark C. Howell Jr., Andrew McGill, Ryan Green und Shyam S. Mohapatra

Abteilung für Molekulare Medizin, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2525, Tampa, FL, 33612, USA

Karthick Mayilsamy, Andrew McGill und Subhra Mohapatra

Fachbereich Physik, University of South Florida, Tampa, FL, 33612, USA

Dmitri V. Voronine

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Literatursuche und Datenanalyse: SA, MCH, RG, ARM, KM Laser- und Hohlraumstudien: SA, MCH, RG, KM, RG, SM, SSM und DVV Virusinaktivierungsanalysen: SA, MCH, RG, KM, SM, DVV und SSM haben das Manuskript geschrieben: SA, MCH, RG, ARM, RD, SM, DVV und SSM Abbildung: SA, MCH, KM, ARM, SM, DVV und SSM Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt .

Korrespondenz mit Subhra Mohapatra, Dmitri V. Voronine oder Shyam S. Mohapatra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ambardar, S., Howell, MC, Mayilsamy, K. et al. Ultraschnelles UV-Laser-Integrationshohlraumgerät zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 und anderen Viren. Sci Rep 12, 11935 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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Eingegangen: 28. Januar 2022

Angenommen: 26. Mai 2022

Veröffentlicht: 13. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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