Hemmende Wirkung von 405-nm-Laserlicht auf bakteriellen Biofilm in Harnröhrenstents

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3908 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der klinische Einsatz von Harnröhrenstents wird in der Regel durch verschiedene Nebenwirkungen erschwert, darunter Dysurie, Fieber und Harnwegsinfektionen (UTI). Am Stent haftende Biofilme (gebildet durch Bakterien wie Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus) verursachen bei Stentpatienten Harnwegsinfekte (ca. 11 %). Zu den unerwünschten Folgen des Antibiotika-Einsatzes zählen Bakterienresistenzen, Gewichtszunahme und Typ-1-Diabetes, die bei längerem Antibiotika-Einsatz auftreten. Unser Ziel war es, die Wirksamkeit einer neuen optischen Behandlung mit einem 405-nm-Laser zur Hemmung des Bakterienwachstums in einem Harnröhrenstent in vitro zu bewerten. Der Harnröhrenstent wurde drei Tage lang in S. aureus-Brühemedium gezüchtet, um unter dynamischen Bedingungen eine Biofilmbildung zu induzieren. Es wurden verschiedene Bestrahlungszeiten mit dem 405-nm-Laserlicht getestet (5, 10 und 15 Minuten). Die Wirksamkeit der optischen Behandlung auf Biofilme wurde quantitativ und qualitativ bewertet. Die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies trug dazu bei, den Biofilm über dem Harnröhrenstent nach 405-nm-Bestrahlung zu beseitigen. Die Hemmungsrate entsprach einer 2,2-log-Reduktion der koloniebildenden Einheiten/ml Bakterien nach 10-minütiger Bestrahlung mit 0,3 W/cm2. Der behandelte Stent zeigte im Vergleich zum unbehandelten Stent eine deutliche Verringerung der Biofilmbildung, wie durch SYTO 9- und Propidiumiodid-Färbung nachgewiesen wurde. MTT-Assays mit der Zelllinie CCD-986sk zeigten nach 10-minütiger Bestrahlung keine Toxizität. Wir kommen zu dem Schluss, dass die optische Behandlung mit 405-nm-Laserlicht das Bakterienwachstum in Harnröhrenstents ohne oder mit minimaler Toxizität hemmt.

Harnröhrenstents (USs) werden zur Behandlung von Blasenaustrittsobstruktionen eingesetzt, die durch verschiedene Krankheiten verursacht werden. Harnröhrenstrikturen, benigne Prostatahyperplasie (BPH) und Detrusor-Sphinkter-Dyssynergie (DSD) sind Indikationen für die US-Einlage bei geeigneten Patienten1. Typischerweise besteht der US aus einer Metalllegierung (Nitinol), Polymermaterialien oder biologisch abbaubarem Material, das robust genug ist, um die Durchgängigkeit der Harnröhre aufrechtzuerhalten. Culha et al. haben über eine langfristige US-Wirksamkeit von 63 % bei Patienten mit wiederkehrenden Harnröhrenstrikturen berichtet2. Daher sind die erfolglosen Folgen der Stentimplantation, wie Stentmigration, Verkrustungen, chronische Harnwegsinfektionen, Harnröhrenschmerzen und Restenose, die Komplikationen der Stentinsertion3. Riedl et al. entdeckten, dass alle Patienten mit chronisch verweilenden Stents eine Stentkolonisierung und Bakteriurie aufweisen. Temporäre Stents sind mit einer Vorkommensrate von 69 % ebenfalls weit verbreitet und 45 % der Patienten sind von Bakteriurie betroffen; Eine solche mikrobielle Besiedlung verursacht Harnwegsinfektionen4. Harnwegsinfektionen werden durch grampositive und negative Bakterien wie Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis und Staphylococcus aureus (S. aureus) sowie bestimmte Pilze verursacht5.

Bei der Implantation steriler US in den menschlichen Körper kann es zu einer Harnwegsinfektion kommen. Unter Biofilm versteht man eine Ansammlung von Bakterien und ihren extrazellulären Nebenprodukten, die auf der Oberfläche eine organisierte Gemeinschaft bilden6. Das Wachstum von Biofilmen wirkt sich erheblich auf Fremdkörper oder Geräte aus, die in den menschlichen Körper implantiert werden. In den letzten Jahrzehnten wurde eine breite Palette von Fremdkörpern wie US, implantierbare Geräte und Schlingen für urologische Anwendungen entwickelt6. Daher sind die Biofilme auf der Oberfläche eines Implantats hochstrukturiert und bestehen aus aktiv wachsenden Populationen von Bakterien, Proteinen und extrazellulären Polymeren. Die erhöhte Biofilmbildung kann zu Antibiotikaresistenzen der Bakterien und chronischen Infektionen führen7.

Derzeit werden Antibiotika und Stent-Oberflächenbeschichtungen zur Vorbeugung von Harnwegsinfektionen eingesetzt8. Obwohl die meisten Antibiotika weit verbreitet sind, können einige antimikrobielle Mittel bei längerer Anwendung potenzielle Nebenwirkungen haben9. Zu den Risiken des Einsatzes von Antibiotika gehören Bakterienresistenz, Fettleibigkeit und Diabetes10. Zu den nachteiligen Auswirkungen des Einsatzes von Antibiotika können eine Malabsorption, die zu einer Zöliakie-ähnlichen Erkrankung führt, eine verringerte Medikamentenaufnahme, ein veränderter Stoffwechsel und eine veränderte Aufnahme von Vitaminen, die Besiedlung durch resistente Organismen und eine veränderte Anfälligkeit für Infektionen gehören11. Die Laseranwendung zur Bakterienhemmung über optische Fasern gewinnt als alternative Methode zur Lösung dieser Probleme zunehmend an Bedeutung12,13.

Ein breites Spektrum an Wellenlängen kann angewendet werden (von 400 bis 1000 nm), und unter den Wellenlängen hat sich blaues Licht als wirksam bei der Reduzierung der Lebensfähigkeit verschiedener Bakterienarten erwiesen, darunter Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) und Helicobacter pylori , Porphyromonas gingivalis und Pseudomonas aeruginosa, während die meisten Spektren bei hoher Bestrahlungsstärke in der Lage sind, Bakterien selbst bei geringer Bestrahlungsstärke durch photothermische Wirkung abzutöten14,15. Eine andere Laserquelle, beispielsweise ultraviolettes (UV-)Licht, ist ebenfalls als Bakterizid bekannt. Aufgrund der zytotoxischen Wirkung auf Säugetiergewebe ist die In-vivo-Nutzung von UV-Licht jedoch eingeschränkt16. Dai, et al. entdeckten einen Keratinozytenverlust von 57 %, als sie eine UV-Lichttherapie bei Zentrallinieninfektionen untersuchten14. Diese Zytotoxizität weist darauf hin, dass die Anwendung von UV-Licht, obwohl es sich um ein wirksames antimikrobielles Mittel handelt, möglicherweise nicht die ideale Wahl für lebendes Gewebe ist17. Daher wird 405-nm-Laserlicht (blaues Licht) häufig zur bakteriellen Desinfektion eingesetzt18,19. Maclean et al. stimmten darin überein, dass oxidative Schäden an den Bakterien und Photoanregung von Porphyrinen bei der Wellenlänge 405 nm die höchste keimtötende Aktivität erzeugen könnten20,21. Darüber hinaus können Porphyrine und andere photoaktive Substanzen Bakterien dekontaminieren, indem sie durch die Absorption des 405-nm-Lichts reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen. ROS sind eine Klasse freier Radikale, die aus Singulettsauerstoff, Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid und Hydroxylradikalen besteht. Während der bakteriellen Zytotoxizität werden endogene lichtempfindliche Moleküle (Porphyrine) unter der Einwirkung von violett-blauem Licht (405 nm) photoangeregt und erzeugen ROS. Die ausreichende Produktion von ROS führt durch oxidativen Stress zur Zelllyse. Im Allgemeinen erfolgt die Produktion von ROS in Bakterien während der photodynamischen Therapie (PDT) über zwei Wege: Typ 1 und Typ 2. Bei Typ 1 reagiert endogenes Porphyrin direkt mit den zellulären Komponenten, einschließlich Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen Mikromolekülen , um Superoxidanionen und Hydroxylradikale zu erzeugen, was wiederum zur Produktion anderer ROS-Moleküle führt. Beim Typ 2 verbindet sich Porphyrin mit molekularem Sauerstoff und bildet Singulett-Sauerstoff. Dieser Mechanismus führt anschließend zu einer oxidativen Schädigung lichtexponierter Bakterienzellen und führt zum Zelltod21,22. Es wurde berichtet, dass andere Mechanismen, wie die Zerstörung von Bakterienmembranen und DNA-Schäden, auf die Wirkung von blauem Licht zurückzuführen sind23.

Obwohl Antibiotika zur Behandlung von Harnwegsinfekten eingesetzt werden, sind die derzeitigen Medikamente immer noch mit verschiedenen Nebenwirkungen wie Fettleibigkeit und Bakterienresistenz verbunden. Ziel der aktuellen Studie war die Untersuchung einer alternativen Behandlung von Harnwegsinfektionen durch Bestrahlung des in den USA gewachsenen Bakterienbiofilms mit Laserlicht über ein optisches Gerät. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass der Einsatz von 405-nm-Laserlicht den bakteriellen Biofilm als Phototherapie bei Stentpatienten hemmen könnte, um Harnwegsinfektionen vorzubeugen. Diese In-vitro-Studie wurde als erste Untersuchung zur alternativen Behandlung von Harnwegsinfekten konzipiert. Ein 405-nm-Laser aus einem in den Korb integrierten optischen Gerät wurde verwendet, um Licht auf die Innenfläche des US zu liefern. Für Sicherheitsbewertungen wurden MTT-Assays verwendet, um die Wirkung von 405-nm-Laserlicht als phototherapeutisches Mittel zur Hemmung der bakteriellen Biofilmbildung in menschlichen Zelllinien zu bewerten. Die vorgeschlagene optische Behandlung kann eine praktikable alternative Behandlung für bakterielle Infektionen bei Stentpatienten sein.

Der Zustand der Bakterienkultur in den USA wurde mithilfe der CV-Färbemethode analysiert, um die Annäherung an die Lebensfähigkeit der Bakterien während der Kultivierungszeit abzuschätzen. Jeder Tag bietet die unterschiedlichen Biofilmbildungen, basierend auf Abb. 1a (0–3 Tage Kultivierung). Die CV-Färbung fungierte als interkalierender Farbstoff, der zur schnellen Visualisierung von Biofilmen verwendet wird, und die Färbung ermöglichte die Quantifizierung von Zellen, wie in Abb. 1b dargestellt. Die Schätzung der Biofilmbildung am Tag 3 erreichte mehr als 80 % im Vergleich zu der am Tag 0.

Wachstum von bakteriellem Biofilm: (a) mit Kristallviolett gefärbte Harnröhrenstents zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kultivierung und (b) Lebensfähigkeit der Bakterien im Vergleich zur Kulturzeit.

Es wurde ein MTT-Experiment durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen sowohl vor als auch nach der Behandlung zu bewerten und eine alternative Methode zur Entfernung des bakteriellen Biofilms aus den USA mit 405-nm-Laserlicht auszuwählen. Behandelte Zellen zeigten nach 24-stündiger Inkubation im Vergleich zur Kontrolle eine verminderte Zelllebensfähigkeit von 2 % (5 Min.), 4 % (10 Min.) und 10 % (15 Min.) (p < 0,05). Die Ergebnisse des MTT-Tests zeigten, dass die 15-minütige Laserbestrahlung eine toxische Wirkung auf die Zellen hatte und zu einer Zellreduktion von mehr als 10 % führte (Abb. 2a). Die Temperaturentwicklung in Abb. 2b zeigt, dass das Maximum bei 15-minütiger Bestrahlung eine Temperatur von 32 °C erreichte.

Reaktion normaler Zellen (CCD-986sk) auf 405-nm-Laserbestrahlung: (a) Zelllebensfähigkeiten verschiedener Bestrahlungszeiten (CTRL = Kontrolle; (*p < 0,05 vs. CTRL; N = 5) und (b) Temperaturentwicklung während des Lasers Bestrahlung der Oberfläche einer CCD-986sk-Suspension in DMEM-Medien.

Mithilfe der CV-Färbung wurde das Überleben der Bakterien vor und nach der Laserbehandlung berechnet, um die hemmende Wirkung von 405-nm-Laserlicht auf S.aureus zu bewerten. Wie in Abb. 3a dargestellt, verringerte sich die Lebensfähigkeit der Bakterien in 5 Minuten um 26 % (p < 0,05), in 10 Minuten um 59 % (p < 0,001) bzw. in 15 Minuten um 68 % (p < 0,001). Die maximale Temperatur auf der Stentoberfläche erreichte 37,5 °C (Abb. 3b).

Hemmung des bakteriellen Biofilms nach 405-nm-Laserbestrahlung: (a) Lebensfähigkeit der Bakterien nach Bestrahlung mit 405-nm-Laserlicht bei verschiedenen Bestrahlungszeiten (CTRL = Kontrolle; *p < 0,05 und **p < 0,001 vs. CTRL; N = 5) und (b) Temperaturentwicklung während der Laserbestrahlung auf der Oberfläche des Harnröhrenstents.

Abbildung 4a zeigt die Bestimmung von S.aureus in CFU nach 405-nm-Bestrahlung, und jede Behandlungsbedingung zeigt eine andere Anzahl von Kolonien (N = 10). Die Ergebnisse zeigten, dass die Gesamtkolonie nach der Bestrahlung abnahm und in log KBE/ml dargestellt wurde (1,2 log, 2,2 log und 3,2 log Reduktion für 5, 10 und 15 Minuten) (Abb. 4b). Obwohl die maximale Hemmung bei 15-minütiger Bestrahlung (270 J/cm2) eine Reduzierung um 3,2 log (p < 0,01) erreichte, nahm die Lebensfähigkeit menschlicher Zellen (CCD-986sk) (Abb. 2a) unter denselben Bedingungen ebenfalls um mehr als 10 % ab. . Somit könnte die 10-minütige Laserbestrahlung die minimale Hemmungsrate (2–3 log-Reduktion) erreichen, um die Biofilmbildung in den USA mit der Sicherheitsbehandlungsdosis zu verhindern.

Hemmung von S. aureus-Bakterien nach Belichtung mit einem 405-nm-Laser bei verschiedenen Bestrahlungszeiten: (a) Bakterienzellen auf Agarplatten (CTRL = Kontrolle) und (b) Quantifizierung der Bakterienentfernung in log KBE/ml (*p < 0,05 und ** p < 0,01 vs. CTRL; N = 10).

Abbildung 5a zeigt die durch NBT-Färbung bestimmten Niveaus der ROS-Erzeugung, die in die Zellmembran eingetragen wurden. Das Ergebnis zeigt, dass der NBT die ROS-Erzeugung bei allen behandelten Erkrankungen erkennen konnte. Die Ergebnisse der ROS-Erzeugung betrugen 21,7, 46,7 und 74,4 % (p < 0,05) für 5, 10 bzw. 15 Minuten. Diesem Ergebnis zufolge könnte eine längere Bestrahlung mit einem 405-nm-Laser mehr ROS erzeugen, die den Zelltod beeinflussen. Abbildung 5b zeigt das Ergebnis der Abfangaktivität von Antioxidantien mithilfe des DPPH-Assays. Die Ergebnisse zeigen, dass die freien Radikale nach der ROS-Produktion zunahmen, basierend auf der Bestrahlungszeit mit 405-nm-Laserlicht. Die Behandlungsbedingungen (5, 10 und 15 Minuten) erreichten eine antioxidative Aktivität von 22 % (p < 0,05), 43 % (p < 0,001) bzw. 62 % (p < 0,001) im Vergleich zur Kontrolle. Die Kontrollgruppe (keine Laserbehandlung) zeigte die geringste antioxidative Kapazität, wohingegen die behandelten Gruppen mit steigenden Lichtdosen eine zunehmende antioxidative Kapazität aufwiesen. Die Bakteriengruppe, die 15 Minuten lang die höhere Dosis erhielt, zeigte im Vergleich zur Kontrolle einen statistisch signifikanten Anstieg der DPPH-Fängeraktivität (p < 0,05). Abbildung 5c zeigt die Konzentration der Proteinleckage vor und nach der Behandlung mit der Lowry-Methode. Die Beobachtung der Konzentration des Proteinlecks in 5, 10 und 15 Minuten erreichte 37, 71 bzw. 69 µg/ml. Die größte Proteinleckage nach der Laserbehandlung wurde 10 Minuten nach der Laserbestrahlung gemessen und nahm nach 15 Minuten ab. Die Protein-Leakage-Aktivität erreichte nach 10-minütiger Behandlung einen stationären Zustand, da die Proteinkonzentration nach 15-minütiger Bestrahlung im Vergleich zur 10-minütigen Laserbestrahlung abnahm (p = 0,92). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der 405-nm-Laser das Absterben von Bakterien verstärken könnte, indem er dazu führt, dass Bakterien einem erhöhten oxidativen Stress ausgesetzt werden und die Proteine aus der beschädigten Bakterienmembran austreten können.

Optische Hemmwirkung von 405-nm-Laserlicht gegen S. aureus im Harnröhrenstent: (a) ROS-Erzeugung während der Behandlung, (b) DPPH-Fängeraktivität und (c) Konzentration der Proteinleckage unter Verwendung der Lowry-Methode (*p < 0,05 und ** p < 0,001 vs. CTRL; ns = nicht signifikant; N = 5) und (d) SEM-Bilder von S. aureus nach der Laserbehandlung (blauer, orangefarbener und roter Pfeil stellen dicken Biofilm, aus dem Biofilm freigesetzte Bakterien und bakteriellen Tod dar). mit morphologischer Schädigung (Maßstabsbalken = 2 µm; 20 kX und Maßstabsbalken des Einlasses = 20 µm; 2 kX).

Der Membranintegritätsverlust der bakteriellen Biofilme, die vier verschiedenen Behandlungsbedingungen ausgesetzt waren, ist im REM (Abb. 5d) und in Fluoreszenzbildern in Abb. 6 (STRG, 5, 10 und 15 Minuten) dargestellt. Ein erheblicher Anteil der Bakterienkolonien hat sich in der unbehandelten Kontrolle zu einer dicken Biofilmarchitektur aus extrazellulären Polymermaterialien (blauer Pfeil) entwickelt (Abb. 5d (STRG)). Gemäß Abb. 5d (5 min) zerstörte das 405-nm-Laserlicht den Biofilm und setzte den Biofilm in einer einzelnen Zelle frei (orangefarbener Pfeil). Die Bakterienkolonien im in den USA abgelagerten Biofilm zeigten das Fehlen einer intakten Biofilmmorphologie. In Abb. 5d (10 und 15 Minuten) wurden einige Bakterien beschädigt (roter Pfeil), was auf Zelltod hinweist, und die Bakterien wurden aus den USA entfernt.

Analyse der Integrität der Bakterienmembran nach der Laserbehandlung: (a) lebende Bakterien, gefärbt mit SYTO 9, (b) tote Bakterien, gefärbt mit PI, (c) Quantifizierung der Pixelintensität für lebende Bakterien (grüne Intensität) und (d) Quantifizierung der Pixel Intensität in toten Bakterien (rote Intensität) (**p < 0,001 vs. CTRL; ns = nicht signifikant; N = 7; Maßstabsbalken = 100 µm; 40X).

Die Auswertung von Fluoreszenzbildern ergab, dass der Einsatz von 405-nm-Laserlicht die Anzahl der Bakterienzellen deutlich verringerte und nur noch wenige intakte Zellmembranen übrig blieben. Der SYTO 9 markierte die verbleibende intakte Membran als lebende Bakterien (grüne Farbe), und die Population nach der Behandlung war geringer als die der Kontrolle (Abb. 6a). Propidiumiodid (PI) zeigte, dass die Anzahl der Bakterien nach der Behandlung höher war als die der Kontrolle, was bedeutet, dass nach der Behandlung mehr Membranschäden in roter Farbe dargestellt wurden (Abb. 6b). Die Quantifizierung lebender Bakterien (Abb. 6c), dargestellt in grüner Intensität, bestätigte, dass das 405-nm-Laserlicht den bakteriellen Biofilm in den USA hemmen könnte, was gut mit den Ergebnissen der REM-Bilder übereinstimmt (62, 21 und 4 % für 5, 10). bzw. 15 Minuten (p < 0,001). Die Quantifizierung toter Bakterien bestätigte, dass das 405-nm-Laserlicht die Bakterien hemmen konnte, die nach der 405-nm-Laserbelichtung eine höhere Rotintensität erreichten (17, 68 und 98 % für 5, 10 bzw. 15 Minuten) (Abb. 6d). ).

In der aktuellen Studie wurde versucht, die Wirkung von 405-nm-Laserlicht auf den bakteriellen Biofilm zu verstehen, der in den USA entsteht. Die Laserbehandlung wurde als Versuch eingesetzt, den Einsatz von Antibiotika zu ersetzen oder zu unterstützen, um den Nebenwirkungen vorzubeugen. Eine weitere Behandlung zur Vorbeugung von Harnwegsinfekten ist die Entfernung des Stents, doch damit einhergehend treten immer noch Traumata und andere Risiken auf, wie z. B. schwere urologische Komplikationen nach der Entfernung des Stents und die Harnröhrenobstruktion24,25. Daher kann die alternative Behandlung, beispielsweise eine Laserbestrahlung, eine weitere Option zur Vorbeugung von Harnwegsinfekten sein.

405-nm-Laserlicht hat in den USA die Fähigkeit, die Bildung von bakteriellem Biofilm zu hemmen. Der Mechanismus zur Hemmung der Biofilmbildung beruht auf der ROS-Erzeugung, die den Membranzerfall und den Zelltod beeinflussen kann26,27. Laut einer früheren Arbeit28 absorbierten endogene Porphyrine in Bakterienzellen selektiv 405-nm-Laserlicht und produzierten die intrazellulären ROS, die zur wirksamen Abtötung der Bakterien erforderlich waren. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von ROS zu Lipidperoxidation, Protein- und Nukleinsäureoxidation sowie Enzymhemmung führen, was allesamt zur Zerstörung von Mikroorganismen führen kann21. Giuliano et al. berichteten, dass ein typischer Patient bei einem urologischen Eingriff mit einer positiven Urinkultur 103 Kolonien aufweist29. Die Bakterienreduktion aus der vorliegenden Arbeit bestätigte, dass die Hemmung mit dem 405-nm-Laserlicht nach 15-minütiger Laserbestrahlung mit einer Bestrahlungsstärke von 0,3 W/cm2 die Reduktion um mehr als 3 log reduzieren konnte. Obwohl der Zustand für normale Zellen unbedeutend toxisch war (Abb. 2), sollte die Sicherheitsdosis für diese Behandlung vor klinischen Übersetzungen dennoch bestätigt werden. Bauer et al. berichteten, dass zytotoxische Wirkungen bei 300 J/cm2 nach 405-nm-Laserbelichtung festgestellt wurden30. Ein nach 15-minütiger Laserbestrahlung (270 J/cm2) durchgeführter MTT-Assay bestätigte ebenfalls zytotoxische Wirkungen mit einer Zellreduktion von mehr als 10 %. Daher könnte die 10-minütige Laserbestrahlung mit 405-nm-Laserlicht die sichere Dosis (180 J/cm2) mit einer Zellreduktion von weniger als 10 % und einer Bakterienreduktion von 2,2 log sein.

Die ROS-Erzeugung nach einer 405-nm-Laserbehandlung wurde mithilfe der NBT-Färbung untersucht, die mit Superoxidionen interagiert, um einen unlöslichen und stabilen intrazellulären violetten/blauen Formazan-Niederschlag zu erzeugen31. Die Produktion von ROS wird durch die Einwirkungszeit des 405-nm-Lasers auf Bakterien beeinflusst. Je länger die Bakterien Licht ausgesetzt werden, desto mehr ROS können in jedem Zustand nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde die durch ROS beeinflusste Abfangaktivität mit einem DPPH-Assay durchgeführt, der ähnliche Ergebnisse wie die ROS-Erzeugung nach der Laserbehandlung lieferte. Die Fähigkeit des 405-nm-Lasers, der mit Bakterien interagiert, um Wasserstoff an DPPH abzugeben und ihn in DPPH-H umzuwandeln, wird als Wirksamkeit beim Abfangen freier Radikale angesehen. Dieses Phänomen führte zu einer Abnahme des Absorptionswerts, nachdem die radikale violette Farbe (DPPH) in die gelbe Farbe (DPPH-H) geändert wurde32. Darüber hinaus wurde die Wirkung von 405-nm-Laserlicht auf die Bakterienzellen durch die Schätzung des Proteinaustritts nach der Lowry-Methode bestätigt. Interessanterweise stieg die Konzentration des Proteinaustritts nach der Behandlung an, aber bei einer 15-minütigen Bestrahlung nahm die Konzentration des beginnenden Proteins ab und führte zu einer geringeren Menge an Proteinfreisetzung, möglicherweise aufgrund des Zerfalls der Proteinmoleküle durch die längere Laserbestrahlung. Die größte Proteinkonzentration trat in 10 Minuten mit 71 µg/ml auf. Da es sich bei dem Protein um eine Art essentieller intrazellulärer Komponente33 handelt, gilt ein Proteinaustritt als Hinweis, der sowohl einen zytoplasmatischen Austritt als auch eine Schädigung der Lipidschicht34 und der Zellmembranen35 umfasst.

Die Wirkung des 405-nm-Lasers auf morphologische Zellen hing von der Bestrahlungszeit des 405-nm-Lasers ab, was zur Entfernung von Biofilm und Zellschäden in 10 und 15 Minuten führte. Die Struktur verändert sich vom perfekten Kreis zum geschrumpften Kreis, verursacht durch den Membranzerfall, der durch REM-Bilder von Bakterien bestätigt wurde. Ein Kriterium zur Bestimmung, ob Bakterienzellen leben oder tot sind, gilt als Zell- und Membranintegrität. Es wird angenommen, dass die lebenden Zellen über intakte und dichte Zellmembranen verfügen, die für einige Färbungen undurchlässig sind, wohingegen man davon ausgeht, dass die toten Zellen zerstörte und/oder beschädigte Membranen aufweisen36. Die Färbung mit SYTO 9 bindet an DNA und RNA und emittiert grüne Fluoreszenz, während PI nur in Zellen mit der beschädigten Membran eindringen kann, die an DNA und RNA bindet und die roten Fluoreszenzsignale emittiert37. Der Membranintegritätsverlust nach 10 und 15 Minuten Laserbestrahlung hatte im Vergleich zur Kontrolle eine geringere Intensität der grünen Pixel und eine höhere Intensität der roten Pixel. Es wurde bestätigt, dass der 405-nm-Laser den Membranzerfall der Bakterien verursachte und nach der Behandlung rote Fluoreszenzsignale von den toten Bakterien emittierte.

Für klinische Anwendungen wird erwartet, dass die vorgeschlagene Methode bei Patienten mit Harnwegsinfektionen eingesetzt wird, indem ein in den Korb integriertes optisches Gerät in die Harnröhre eingeführt und auf dem US positioniert wird. Die streuende optische Faser im Harnröhrenkanal kann 405-nm-Laserlicht auf die Oberfläche des Harnröhrenkanals strahlen, um die Bildung eines bakteriellen Biofilms auf dem Harnröhrenkanal mit photohemmender Wirkung zu verhindern oder zu minimieren. In weiteren Arbeiten sollte daher ein In-vivo-Modell getestet werden, um klinische Dosen zu untersuchen und die optimale Dosis an einen Harnröhrenkanal und periphere Gewebe anzupassen. Die minimale Hemmungsrate zur Entfernung von 103 Kolonien könnte unter Echtzeitbedingungen unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, Experimente unter Bedingungen durchzuführen, die den Harnröhrenkanal nachahmen können. Um es zu einer der Behandlungsmöglichkeiten für Harnwegsinfekte bei Stentpatienten zu machen, müssen wir die photohemmende Wirkung gegen urologische Erkrankungen wie Harnröhrenobstruktion und Harnröhrenstriktur klären und überwachen. Abschließend sollte eine Pilotstudie durchgeführt werden, um die klinischen Behandlungsbedingungen wie Laserleistung, Bestrahlungszeit sowie Anzahl und Dauer der Behandlungen zu identifizieren und zu optimieren sowie die Wirksamkeit und Sicherheit für klinische Übersetzungen zu validieren.

Zusammenfassend zeigte die vorliegende Arbeit die Wirksamkeit eines 405-nm-Laserlichts zur Bakterienhemmung in den USA mit einer Bakterienreduktion von 2–3 log und einem Sicherheitsspielraum. Die ROS-Erzeugung nach der 405-nm-Laserbestrahlung des Biofilms trug zum Proteinaustritt, zum Membranzerfall und zum Zelltod bei. In weiteren Studien wird die gleichzeitige bakterielle Hemmung mithilfe des Multibakteriums in vivo untersucht, um das Risiko einer Harnwegsinfektion bei Stentpatienten zu verringern, indem die durch den längeren Einsatz von Antibiotika verursachte bakterielle Resistenz verringert wird.

Sterile USs wurden von UVENTA™ Harnröhrenstent gekauft; TAEWOONG Medical, Südkorea. Der US war selbstexpandierbar, hatte eine Länge von 80 mm und einen Durchmesser von 10 mm und bestand aus einer implantierbaren, vollflächigen Metallstruktur aus Nitinoldraht, die mit einer dünnen Silikonschicht (nicht biologisch abbaubar) bedeckt war. S. aureus (KCTC 1916) aus einer Bakterienstammkultur (− 80 °C) wurde in eine Agarplatte gegeben und 24 Stunden lang inokuliert. Anschließend wurden die Bakterien in tryptischer Sojabrühe (TSB) (50 ml) subkultiviert und 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert. Um die Anzahl der Bakterienkolonien zu bestimmen, wurde die McFarland-Methode38 verwendet, um 108 Kolonien in 10 ml zu erhalten. Zunächst wurde frisches Medium mit einer Bakteriensuspensionsinjektion (10 ml) in einen kleinen Silikonschlauch (Innendurchmesser = 4 mm; Außendurchmesser = 5 mm; Sungjin, Südkorea) gepumpt (P1 = 1,5 ml/min). Dann wurde die zweite Pumpe (P2 = 50 ml/min) eingeschaltet, als P1 das Medium durch den Silikonschlauch abgelassen hatte, und wurde verwendet, um das größere Silikonmedium abzulassen (Innendurchmesser = 10 mm; Außendurchmesser = 12 mm; Sungjin, Südkorea) für drei Tage. Ein US wurde in einen größeren Silikonschlauch gegeben und das Silikon in ein Wasserbad bei 37 °C gegeben. Anschließend floss das verwendete Medium in eine andere Flasche. Alle 4 Stunden wurde frisches Medium mit P1 gepumpt, um zu verhindern, dass die Bakterien wachsen und in den USA einen gleichmäßigen Biofilm bilden. Es ist zu beachten, dass sich der aktuelle Prozess auf die Entwicklung des bakteriellen Biofilms in den USA in vitro konzentrierte, was kaum klinische Bedingungen nachahmt. Abbildung 7A zeigt den Aufbau. Nach dreitägiger Kultivierung wurden die USA mit Kristallviolett (CV) angefärbt, um festzustellen, ob sich während der Kultivierungstage ein Biofilm gebildet hat, wie in Abb. 7b dargestellt.

Schematische Darstellungen der Bakterienvorbereitung: (a) Bakterienkultivierung in einem Harnröhrenstent unter dynamischen Bedingungen, (b) Beispiele eines Harnröhrenstents vor (Tag 0) und nach der Kultivierung und (c) Aufbau einer 405-nm-Laserbehandlung. (Tag 3; gefärbt mit Kristallviolett; TSB = tryptische Sojabrühe-Medien; SA = S. aureus-Suspension; WB = Wasserbad; US = Harnröhrenstent; UM = verwendete Medien; P1, P2 = Pumpe, S1 = kleines Silikon, S2 = großes Silikon und DF = diffundierende Faser).

Das in dieser Studie verwendete korbintegrierte optische Gerät wurde angepasst, indem die Korbform, der Durchmesser (10 mm) und die Charakterisierung des für das Korbgerät verwendeten Materials aus früheren Arbeiten geändert wurden39. Der Korb, in den ein optischer Diffusor integriert ist, zielt darauf ab, die Position der streuenden Faser in der Mitte beizubehalten, wenn er in den USA platziert wird, sodass die Lichtausbreitung in alle Richtungen gleichmäßig erfolgen kann. Als Lichtquelle wurde blaues Licht (405 nm; CNI-Laser, Changchun, VR China) mit einer Bestrahlungsstärke von 0,3 W/cm2 verwendet. Die Behandlungsbedingungen wurden je nach Bestrahlungsdauer von 5, 10 und 15 Minuten variiert. Bei der Kontrolle handelte es sich um eine unbehandelte Erkrankung. Die entsprechenden Fluenzen betrugen 90, 180 und 270 J/cm2. Für den Behandlungsbereich haben wir den Stent auf eine Länge von 10 mm zugeschnitten und das 405-nm-Laserlicht im Inneren des Stents bestrahlt. Ein Versuchsaufbau wurde entwickelt, indem der kultivierte US in einen Standhalter gestellt und dann ein in einen Korb integriertes Gerät in die gleiche Richtung positioniert und in der Mitte in den US eingeführt wurde. Eine Infrarotkamera (FLIR A325, 320 × 240 Pixel, Auflösung = 25 μm, Spektralbereich = 7,5–13 μm; FLIR, Wilsonville, Oregon) wurde 30 cm über der US-Oberfläche platziert und mit einem Personalcomputer gesteuert, um die Temperaturentwicklung währenddessen zu überwachen Behandlung (Abb. 7c).

Der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay (MTT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zur Bewertung der Sicherheit und Toxizität des 405-nm-Laserlichts verwendet . Die CCD-986sk-Zelllinie (bezogen von der Korean Cell Line Bank) wurde unter allen Behandlungsbedingungen als normale Zelllinie verwendet. CCD-986sk-Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37 ° C aufgetaut, in ein konisches 15-ml-Röhrchen gegeben, 3 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, Corning, NY, USA) zugegeben und die Suspension bei 1000 × zentrifugiert g für 5 Min. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden für 48 Stunden in eine Kulturschale mit 10 ml DMEM gegeben. Alle zwei bis drei Tage wurde eine Zellsubkultur durchgeführt, um eine stabile Zelllinie für den MTT-Assay zu erhalten. Die stabilen Zelllinien wurden gezählt, in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, damit die Zellen vor der Behandlung gut wachsen konnten. Die Zellen wurden gemäß den in den USA angewandten Behandlungsbedingungen (Bestrahlungszeiten: 5, 10 und 15 Minuten) mit einer Bestrahlungsstärke von 0,3 W/cm2 behandelt. Behandelte Zellen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, MTT-Lösung zugegeben und 3 Stunden im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die MTT-Lösung wurde entfernt, durch Dimethylsulfoxid (DMSO) ersetzt und 15 Minuten lang inkubiert. Die Absorption wurde spektrophotometrisch bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; N = 10 pro Bedingung) bestimmt.

Nach der Behandlung wurde die CV-Färbung verwendet, um die Lebensfähigkeit der Bakterien abzuschätzen, indem die USA mit destilliertem Wasser gewaschen und 20 Minuten lang in CV-Lösung inkubiert wurden. Anschließend wurde eine Solubilisierungslösung zugegeben (95 % Ethanol mit 5 % destilliertem Wasser) und 10 Minuten lang beschallt. Die Bakterienlösungen wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und ihre Absorption bei 570 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; N = 10 pro Bedingung) gemessen. Darüber hinaus wurde die Lebensfähigkeit der Bakterien anhand koloniebildender Einheiten (KBE) berechnet. Zehn Millimeter US wurden mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen gegeben. Die USA wurden 10 Minuten lang beschallt und 5 Minuten lang verwirbelt. Anschließend wurde die Bakteriensuspension zehnfach verdünnt und 100 μl der Suspension auf einer Trypton-Soja-Agarplatte (TSA) ausgebreitet und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Agarplatten mit OpenCFU40 analysiert, um die Anzahl der Bakterienkolonien zu berechnen, die durch die logarithmische Zahl der Lebensfähigkeit der Bakterien auf der 10-mm-US-Oberfläche dargestellt wird (KBE/ml, N = 10 pro Bedingung).

Um den vorherrschenden Mechanismus der vorgeschlagenen Behandlung zu untersuchen, wurden sowohl der Kontroll- als auch der behandelte US in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 1 ml destilliertem Wasser gegeben, 20 Minuten lang beschallt und 5 Minuten lang gevortext, um die Bakterien im US abzulösen. Eine 1-mg-Lösung von Nitroblau-Tetrazolium (NBT) wurde in das Röhrchen gegeben und 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Nachdem der Lösung 0,1 M HCl zugesetzt worden war, um die bakterielle Wechselwirkung mit NBT zu hemmen, wurden alle Röhrchen 5 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Um interzelluläre ROS freizusetzen, wurden die Pellets zunächst mit 800 ml Kochsalzlösung und 400 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt. Um die ROS-Erzeugung abzuschätzen, wurden 200 μl jeder Probe in eine 96-Well-Platte gegeben und bei 575 nm gemessen (N = 5 pro Bedingung). Die gesammelte ROS-Erzeugung wurde durch die Absorption von Kontrollproben normalisiert, um experimentelle Fehler auszuschließen, die durch das Ultraschallverfahren verursacht wurden. Die folgende Gleichung wurde verwendet, um den Grad der interzellulären ROS-Amplifikation (Ri) zu bestimmen:

Dabei ist Ac die Absorption der Kontrolle und At die Absorption der behandelten Probe.

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ist ein stabiles freies Radikal, das zur Bewertung der allgemeinen Radikalfängerfähigkeiten verschiedener Antioxidantien nach der ROS-Erzeugung verwendet wird. DPPH-Assays wurden durchgeführt, indem die DPPH-Lösung (40 µg/ml Methanol) zu den Kontroll- und behandelten Zellen gegeben und 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert wurde. Zur Bestimmung der Absorption bei 517 nm wurde ein UV-Spektrophotometer verwendet und das Experiment fünfmal wiederholt. Eine logarithmische Dosierungshemmungskurve wurde verwendet, um den IC50-Wert41 des Standards zu ermitteln, der die Konzentration des Standards darstellt, die erforderlich ist, um 50 % des freien DPPH-Radikals zu hemmen. Die geringere Absorption der Reaktionsmischung deutete auf eine erhöhte Aktivität freier Radikale hin. Die folgende Gleichung wurde verwendet, um den Prozentsatz des DPPH-Fängereffekts (Ds) zu berechnen.

Dabei ist Ac die Absorption der Kontrolle und At die Absorption der behandelten Probe.

Die von Lowry et al. beschriebene Methode. (1951) wurde verwendet, um das von S. aureus-Zellen freigesetzte Protein (106 KBE/ml) vor und nach 24-stündiger Behandlung mit 405-nm-Laserlicht zu bewerten. Die Absorption wurde spektrophotometrisch bei 660 nm gemessen. Die Menge des freigesetzten Proteins wurde durch Extrapolation einer Gleichung aus der Kalibrierungskurve unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) bestimmt, wie zuvor beschrieben42.

Um die Architektur der Biofilmbildung zu bewerten, wurden Kontroll- und behandelte US mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2,5 % Glutaraldehyd mit pH 7,5 4 Stunden lang bei Raumtemperatur (26 °C) fixiert. Nach der Inkubation wurden die USA mit 100 % Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Kontroll- und behandelten US-Zellen wurden in kleine Stücke (5 mm) geschnitten und zur SEM-Analyse mit Gold-Palladium bedeckt.

Ein LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Bio Probes, Eugene, OR, USA) wurde verwendet, um lebende und tote Bakterien auf der Grundlage der Membranintegrität der Kontroll- und behandelten Stents zu bewerten. Die Bakteriensuspension aus der Kontrolle und dem behandelten US wurde 5 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert, um den am Stent haftenden Bakterienbiofilm zu sammeln. Anschließend wurden SYTO 9- und Propidiumiodid (PI)-Färbungen in einer Konzentration von 1:1 zugegeben und 15 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde 1 μl Suspension auf einen Glasobjektträger gegeben und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Deckglas abgedeckt. Lebende und tote Bakterien werden in Grün bzw. Rot dargestellt. Eine quantitative Analyse der Fluoreszenzbilder wurde durchgeführt, indem die Gesamtzahl der grünen und roten Pixelintensitäten verwendet und die RGB-Werte mit Image J (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) berechnet wurden.

Die Daten werden als Mittelwert und Standardabweichung unter vier Bedingungen dargestellt: eine als Kontrolle und drei weitere Behandlungsbedingungen (Bestrahlungszeiten: 5, 10 und 15 Minuten). Jede Bedingung (Kontrolle und Behandlung) wurde fünfmal wiederholt (N = 5). Die KBE-Analyse wurde in 10 Wiederholungen durchgeführt, um geeignete Daten sicherzustellen. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um alle Bedingungen durch Vergleich der Kontroll- und Typbedingungen zu bewerten. Für die statistische Analyse wurde SPSS (SPSS, Chicago, USA) verwendet und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Dieser Artikel enthält keine von einem der Autoren durchgeführten Studien mit menschlichen Teilnehmern.

Alle relevanten Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind im Artikel enthalten. Weitere Informationen und Daten sind auf begründete Anfrage beim Autor (LM; [email protected]) erhältlich.

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Die Autoren möchten Dr. Sirajunnisa Abdul Razack, Postdoktorandin am Marine Integrated Biomedical Technology Center, The National Key Research Institutes in Universities, Pukyong National University, Busan, Korea, für ihren technischen Leitfaden zur Analyse in dieser Studie danken.

Diese Arbeit wurde durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (Nr. 2021R1A2C2003733) und durch das vom Bildungsministerium finanzierte Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt (Nr. 2021R1A6A1A03039211).

Industrie 4.0 Konvergenz-Bioniktechnik, Pukyong National University, Busan, Korea

Luluil Maknuna, Van Nam Tran und Hyun Wook Kang

Marine-IntegratedIntegrated Biomedical Technology Center, National Key Research Institutes in Universities, Pukyong National University, Busan, Korea

Luluil Maknuna & Hyun Wook Kang

Abteilung für intelligentes Gesundheitswesen, Hochschule für Informationstechnologie und Konvergenz, Pukyong National University, Busan, Korea

Byeong-Il Lee & Hyun Wook Kang

Abteilung für Biomedizintechnik, Pukyong National University, Busan, 48513, Republik Korea

Hyun Wook Kang

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LM, VNT und HWK konzipierten und gestalteten die Forschung. LM und VNT führten das Experiment durch. LM analysierte die Daten und verfasste das Manuskript. BL führte eine Datenanalyse durch, überarbeitete das Manuskript und unterstützte die Finanzierung. HWK überwachte die Studie, überarbeitete das Manuskript und genehmigte die endgültige Fassung. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Hyun Wook Kang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Maknuna, L., Tran, VN, Lee, BI. et al. Hemmende Wirkung von 405-nm-Laserlicht auf bakteriellen Biofilm in Harnröhrenstents. Sci Rep 13, 3908 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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Eingegangen: 28. September 2022

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 08. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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